高效液相色譜儀(HPLC)現(xiàn)已成為有機(jī)化學(xué)分析的重要手段之一。同樣，在食品分析中，無論是殘留分析還是成分分析，HPLC也已成為*的分析儀器。和其它分析儀器一樣，你若想讓HPLC很好地為你工作、得到可靠的數(shù)據(jù)，首先你要保養(yǎng)好它，使它處于一個(gè)良好的待機(jī)狀態(tài)，這樣你操作它進(jìn)行分析時(shí)就可以比較順利地獲得理想的結(jié)果。而且良好規(guī)范的操作習(xí)慣可以延長(zhǎng)儀器使用壽命。
大家在學(xué)校或接受儀器公司培訓(xùn)的時(shí)候，老師或工程師會(huì)提出很多的操作注意事項(xiàng)。但要是總結(jié)歸納一下，重要的有三點(diǎn)：脫氣、過濾和沖洗。本文圍繞這三點(diǎn)進(jìn)行討論，給新從事HPLC分析的工作者一點(diǎn)操作建議，希望能對(duì)正確的操作儀器有一點(diǎn)幫助。更歡迎有經(jīng)驗(yàn)的專家介紹使用經(jīng)驗(yàn)，提出好建議。
一、脫氣
流動(dòng)相脫氣對(duì)于避免HPLC系統(tǒng)出問題，順利得到一個(gè)理想的數(shù)據(jù)是一個(gè)很有效的措施。HPLC系統(tǒng)內(nèi)是不希望有氣泡存在的。HPLC泵在輸送液體時(shí)要產(chǎn)生很大的力量，由于氣體的壓縮比與液體相比大的多，因而當(dāng)氣泡存在時(shí)，你將觀察到瞬間的流速降低和系統(tǒng)壓力下降。如果這個(gè)氣泡足夠大，液相泵將不能輸送任何溶劑，而且如果壓力低于預(yù)先設(shè)定的壓力低限，泵將停止工作。有些泵設(shè)計(jì)可以很好地排除氣泡，而也有一些泵設(shè)計(jì)當(dāng)氣泡存在時(shí)將停止運(yùn)轉(zhuǎn)。
當(dāng)一個(gè)氣泡通過輸液泵時(shí)，由于系統(tǒng)壓力大，氣泡通常會(huì)溶解在流動(dòng)相溶液中，隨流動(dòng)相通過柱子。但是到達(dá)檢測(cè)器流通池時(shí)系統(tǒng)壓力又恢復(fù)到了大氣壓，因而氣泡可能在檢測(cè)器流通池中又顯現(xiàn)，在色譜圖上會(huì)出現(xiàn)不規(guī)律的毛刺。為解決這個(gè)問題，有些儀器公司設(shè)計(jì)一個(gè)反壓控制器，這樣可以在檢測(cè)器出口提供足夠的壓力保持氣泡始終溶解在流動(dòng)相中直到它們流出檢測(cè)器。當(dāng)然，這個(gè)壓力不能超過流通池所能承受的壓力極限，否則可能損壞檢測(cè)器。
紫外/可見光(UV/VIS)檢測(cè)器的液相色譜圖中的噪音毛刺通常是氣泡進(jìn)入并通過流通池的征兆。有些檢測(cè)器對(duì)空氣的存在也非常敏感，但表現(xiàn)出的征兆與UV/VIS不同，例如有報(bào)導(dǎo)說，當(dāng)使用熒光(FL)檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相中溶解氧的存在可能會(huì)使一些化合物失去熒光性。此外，對(duì)于利用待測(cè)物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)引起電流變化而進(jìn)行檢測(cè)的電化學(xué)(EC)檢測(cè)器，對(duì)流動(dòng)相中的溶解氧的存在也非常靈敏。此外，氣泡的存在有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間不重現(xiàn)。
所以，必須注意消除流動(dòng)相中的空氣，并且還應(yīng)避免空氣由管路(如PTFE管)滲透進(jìn)流動(dòng)相中。
如果適當(dāng)?shù)仃P(guān)注在使用之前脫去流動(dòng)相中溶解進(jìn)的空氣，上述這些問題均能避免，或把影響降至低。常用的脫氣方法有如下幾種：
1、吹氦脫氣法：利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性，在0.1MPa壓力下，以約60mL/min流速通入流動(dòng)相儲(chǔ)液容器中10～15min，可以很有效地從流動(dòng)相中排除溶解的空氣，能排除接近80%的氧氣。采用一個(gè)高效分布式噴射流裝置，一體積的氦氣可從流動(dòng)相中將等體積的幾乎全部氣體排除。這意味著1L氦氣通過1L流動(dòng)相就可完成排氣這個(gè)工作。這種脫氣方法雖然好，但我們國(guó)內(nèi)氦氣價(jià)格較高，很少有實(shí)驗(yàn)室采用此方法。
2、加熱回流法：此法的脫氣效果較好。在操作時(shí)要注意冷凝塔的冷卻效率，否則溶劑會(huì)丟失，混合流動(dòng)相的比例會(huì)有變化。
3、抽真空脫氣法：此法可使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會(huì)使混合溶劑組成發(fā)生變化，從而影響到實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性，因此多用于單溶劑體系的簡(jiǎn)單分析。
4、超聲波脫氣法：將欲脫氣的流動(dòng)相置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩10～20min。此法的脫氣效果zui差。
5、在線脫氣法：現(xiàn)在商品的HPLC儀器，均可配在線脫氣機(jī)。在線脫氣使用簡(jiǎn)單，低故障，有效。建議購買儀器時(shí)一定要購買，有的公司是作為選購件，所以與儀器公司談配置時(shí)應(yīng)與公司確認(rèn)。
二、過濾
任何顆粒物進(jìn)入HPLC系統(tǒng)后都會(huì)在柱子入口端被篩板擋住，zui后的結(jié)果是將柱子堵塞，表現(xiàn)出的特征是系統(tǒng)壓力增加并使色譜峰變形。因此，要采取各種預(yù)防措施，包括操作步驟和商品儀器自身的各種過濾設(shè)計(jì)，努力防止或減少顆粒物進(jìn)入HPLC系統(tǒng)中，從而延長(zhǎng)儀器和色譜柱的使用壽命，并提高數(shù)據(jù)的可靠性。在HPLC系統(tǒng)中，顆粒物的主要來源有三個(gè)途徑：流動(dòng)相、被測(cè)樣品和儀器系統(tǒng)部件的磨損物。
1、流動(dòng)相
如果流動(dòng)相均由高效液相色譜級(jí)溶劑組成，流動(dòng)相沒有必要過濾。這是因?yàn)楦咝б合嗌V級(jí)的有機(jī)溶劑，例如乙腈、甲醇等，在制造的工藝過程中都已經(jīng)過了0.2µm微孔濾膜過濾。同樣的，無論你是買的HPLC級(jí)的水還是在實(shí)驗(yàn)室使用超純水凈化系統(tǒng)制備的水，zui后一步也是通過0.2µm微孔濾膜。然而，如果有任何一種緩沖液中加入了固體物，例如磷酸鹽，流動(dòng)相過濾將是必要的一個(gè)步驟。雖然緩沖鹽可能是可溶解的、高純的，但它還是可能含有顆粒物質(zhì)，例如在蓋試劑瓶的塑料內(nèi)蓋時(shí)，塑料瓶蓋子與瓶口邊緣擠壓就會(huì)產(chǎn)生塑料顆粒。在這種情況下，添加的一種固體物可能*溶解了，但是少量雜質(zhì)顆粒存在于流動(dòng)相中成為殘?jiān)?br />
流動(dòng)相通過0.45µm微孔濾膜過濾對(duì)于從流動(dòng)相中除去所有顆粒物是一個(gè)有效方法。0.2µm微孔濾膜也可以用，但是它們就這個(gè)應(yīng)用而言并不比0.45µm微孔濾膜更有效，而且它的過濾速度會(huì)更慢，特別是當(dāng)實(shí)驗(yàn)室使用的試劑和水的質(zhì)量不太好時(shí)。建議實(shí)驗(yàn)室在編寫制定他們流動(dòng)相制備標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOPs)時(shí)規(guī)定，可以借鑒上同類實(shí)驗(yàn)室的規(guī)定，即：
流動(dòng)相制備僅采用HPLC級(jí)液體時(shí)不需要過濾，反之所有流動(dòng)相組成在使用前必須過濾。
在連接儲(chǔ)液瓶和泵的輸液管的末端入口采用下沉式過濾器(常見材質(zhì)有熔融玻璃砂芯濾板和微孔金屬的兩種)也是很重要的。這個(gè)過濾器的規(guī)格為≥10µm的微孔物質(zhì)，所以它不能取代流動(dòng)相過濾步驟，但是它能除去系統(tǒng)中的塵土并保證儲(chǔ)液瓶、輸液管使用的可靠性。
2、被測(cè)樣品
液相系統(tǒng)中的第二個(gè)顆粒物來源是被測(cè)樣品。一些實(shí)驗(yàn)室在將他們的樣品放置在自動(dòng)進(jìn)樣器盤(或手動(dòng)進(jìn)樣)以前，所有樣品都先通過一個(gè)0.45µm針筒式過濾器過濾。這是一個(gè)有效除去被測(cè)樣品中顆粒物的方法。但是這個(gè)過程也有一點(diǎn)需要關(guān)注：你使用了針筒式過濾器就不可能100%得到通過過濾器的被測(cè)樣品，總會(huì)有或多或少的丟失。丟失來自這樣幾方面：過濾器濾膜的吸附、過濾器濾出的顆粒物上的吸附、針筒式濾膜過濾器與針筒連接處的滲漏等。如果有丟失，過濾后液體中被測(cè)物的含量或濃度與原基本樣液的含量或濃度還相同嗎？這個(gè)問題一般需要通過實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。確認(rèn)這步是要增加工作量和費(fèi)用的。過濾器的使用是一種消耗，每個(gè)過濾器的價(jià)格從幾元到十幾元。但在做食品中殘留物分析時(shí)，由于基質(zhì)大多比較復(fù)雜，所以過濾這步已成為*的一步。在實(shí)際分析工作中，一般檢測(cè)每一組樣品會(huì)帶一個(gè)外標(biāo)、一個(gè)添加回收或是質(zhì)控樣品，所以，只要zui終檢測(cè)時(shí)得到的信噪比能滿足檢出限要求，可將這步視為系統(tǒng)誤差而忽略。
3、儀器系統(tǒng)部件的磨損物
后，在HPLC系統(tǒng)中顆粒物的另一個(gè)主要來源是輸液泵密封墊和進(jìn)樣閥旋轉(zhuǎn)軸的磨損。關(guān)于輸液泵密封墊的磨損更換有兩種不同建議。
一種建議認(rèn)為，在一般實(shí)驗(yàn)室中輸液泵密封墊通常使用壽命為六個(gè)月到一年，因此建議半年或一年更換這些密封墊，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)基于上述觀點(diǎn)制定定期預(yù)防性維護(hù)計(jì)劃。該觀點(diǎn)認(rèn)為：與輸液泵密封墊顆粒堵塞柱子而更換新柱子的費(fèi)用相比，更換密封墊的費(fèi)用低些。一些輸液泵有玻璃砂芯或篩網(wǎng)，可在流路中濾掉從泵密封墊磨損下來的顆粒物，防止這些顆粒物隨流動(dòng)相流至柱頭。若有這種裝置應(yīng)查閱輸液泵操作手冊(cè)，查看推薦的這種過濾器清洗或更換的間隔。
另一種建議則認(rèn)為，原裝密封墊的密封效果較好，更換以后容易引起流動(dòng)相滲漏。所以，只要不漏液就不要輕易更換密封墊。
兩種說法都有其道理，具體如何操作，建議與儀器公司工程師溝通，各公司的儀器還是有些不同的。
自動(dòng)進(jìn)樣器旋轉(zhuǎn)軸的密封隨著使用時(shí)間也會(huì)磨損，但是在我的經(jīng)驗(yàn)中，即便是高負(fù)荷的運(yùn)轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)軸密封墊也可以使用幾年。如果你的自動(dòng)進(jìn)樣器系統(tǒng)有計(jì)數(shù)進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)動(dòng)次數(shù)的功能，你可以設(shè)定一個(gè)警鈴當(dāng)預(yù)設(shè)閥轉(zhuǎn)動(dòng)次數(shù)已達(dá)到時(shí)提醒你。曾有一種說法，進(jìn)樣器多轉(zhuǎn)動(dòng)20,000次，這僅僅是進(jìn)樣10000個(gè)；但這似乎不是實(shí)驗(yàn)室涉及的常規(guī)樣品分析使用壽命，它們的實(shí)際使用壽命會(huì)更長(zhǎng)。旋轉(zhuǎn)軸密封磨損后會(huì)滲液，比較明顯的特征是同一樣品多次進(jìn)樣后，峰面積值差別比較大(RSD>5%)。當(dāng)然，輸液泵的密封墊和旋轉(zhuǎn)軸的密封墊磨損將增加更多研磨物在流動(dòng)相中，加速對(duì)這些部件的損傷。
此外，如果你日常運(yùn)行的流動(dòng)相有緩沖鹽，如磷酸緩沖鹽，密封墊的磨損會(huì)更快。無論顆粒物源于何物，實(shí)驗(yàn)時(shí)都要將其除去。推薦在HPLC系統(tǒng)中采用一個(gè)0.45或0.5µm的在線多孔過濾器，接在自動(dòng)進(jìn)樣器和柱子之間，即使已使用了保護(hù)柱。這個(gè)在線過濾器將成為擋板代替柱頭的濾板，而且如采用一個(gè)玻璃砂芯濾板，既便宜，更換又方便(幾分鐘就可更換)。若采用在線過濾，HPLC系統(tǒng)檢測(cè)每批樣品開始前記錄下壓力值，當(dāng)壓力上升一定值，例如25%或增加500psi，應(yīng)該更換玻璃砂芯濾板了，更換以后沖洗幾分鐘系統(tǒng)將恢復(fù)到原來的壓力值。
三、沖洗
使HPLC系統(tǒng)良好運(yùn)行的第三個(gè)要點(diǎn)是保持系統(tǒng)的清潔。你需要關(guān)注流動(dòng)相流經(jīng)該系統(tǒng)的所有地方，對(duì)于這些地方經(jīng)常性的沖洗，將使你的系統(tǒng)保持在“Ready”狀態(tài)。
1、流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶
首先要經(jīng)常清洗流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶，或者每做一批新樣品更換一次流動(dòng)相。一個(gè)臟的儲(chǔ)液瓶將會(huì)污染注入的流動(dòng)相。建議儲(chǔ)液瓶中緩沖液使用時(shí)間不要超過一周，而有機(jī)溶劑使用時(shí)間不要超過一個(gè)月。也有人建議儲(chǔ)液瓶中保持用溶劑充滿，直到更換分析方法儲(chǔ)液瓶需更換新溶劑(流動(dòng)相組成發(fā)生變化)時(shí)，將舊溶劑倒掉更換新溶劑，這樣勝于將溶劑用完。但這對(duì)于分析樣品量少的實(shí)驗(yàn)室而言似乎有些浪費(fèi)。儀器公司的工程師建議儲(chǔ)水瓶的水要天天換，每周瓶子還應(yīng)該用異丙醇清洗一次。有的實(shí)驗(yàn)室則在水里加入0.1～1mM的甲酸抑制微生物的生長(zhǎng)。這些做法看起來有些繁瑣，但卻能起到“磨刀不誤砍柴工”作用。
2、泵
接下來要沖洗的是泵。千萬不要一分析完沖幾分鐘后就停泵，特別是當(dāng)流動(dòng)相中含有難揮發(fā)的緩沖液(如磷酸鹽)時(shí)。如果儀器不是連續(xù)使用，當(dāng)流動(dòng)相蒸發(fā)時(shí)，難揮發(fā)物就會(huì)粘在活塞密封墊的表面，難揮發(fā)物將形成固形物沉淀。這是泵密封墊磨損和單向閥滲漏的主要原因之一。所以，無論使用長(zhǎng)短，在停泵以前一定要用非緩沖液流動(dòng)相沖洗泵在半個(gè)小時(shí)以上，要是流動(dòng)相中有難揮發(fā)緩沖鹽則建議沖洗的時(shí)間應(yīng)該更長(zhǎng)些。
3、自動(dòng)進(jìn)樣器
自動(dòng)進(jìn)樣器也要按規(guī)定清洗?，F(xiàn)在的儀器多配有自動(dòng)進(jìn)樣器的沖洗液瓶，通常只要注意及時(shí)更換、補(bǔ)充沖洗液即可。自動(dòng)進(jìn)樣器用的洗滌液也要采用與流動(dòng)相相同的方式處理，并根據(jù)溶劑的有效期和規(guī)定，清洗儲(chǔ)液瓶或更換洗滌液。現(xiàn)在的自動(dòng)進(jìn)樣器設(shè)置、操作都很簡(jiǎn)單，如果時(shí)間允許(特別是利用夜間運(yùn)行)，每次分析完后設(shè)置進(jìn)1、2針純?nèi)軇?如甲醇、乙腈)，也是一個(gè)好做法。
4、色譜柱
對(duì)柱子的污染是隨使用時(shí)間而增加。通常表現(xiàn)是：運(yùn)行走基線時(shí)在記錄的色譜圖中基線噪音增加，泵壓也增加。解決這個(gè)問題的zui有效方法就是在每一批樣品分析結(jié)束后或準(zhǔn)備卸下柱子時(shí)用大量的流動(dòng)相沖洗柱子(例如，甲醇、乙腈和水)。用梯度沖洗效果更好，具體的比例要根據(jù)柱子的說明書和性質(zhì)而定。
5、檢測(cè)器
如果是正常使用，檢測(cè)器將依據(jù)其性質(zhì)并按照說明書規(guī)定進(jìn)行洗。例如UV/VIS檢測(cè)器或FL檢測(cè)器，在對(duì)柱子和系統(tǒng)進(jìn)行沖洗時(shí)也就一同對(duì)檢測(cè)器流通池中污染物進(jìn)行了清洗。但是蒸發(fā)光檢測(cè)器或質(zhì)譜儀則需要按照說明書進(jìn)行定期清洗。這些檢測(cè)器在使用時(shí)會(huì)有難揮發(fā)污染物沉積，如質(zhì)譜儀離子源的噴針、毛細(xì)管、錐孔板、預(yù)四極等部件，因而需要定期清洗。而且對(duì)聯(lián)有這些檢測(cè)器的系統(tǒng)沖洗時(shí)，建議與這些檢測(cè)器斷開，以減少對(duì)檢測(cè)器的污染。
總之，實(shí)驗(yàn)室日常使用的液相色譜儀要是能認(rèn)真做好這三項(xiàng)工作——脫氣、過濾和沖洗，你的儀器可以得到良好的預(yù)防性維護(hù)，使用時(shí)就會(huì)感到比較順手。當(dāng)然，在實(shí)際操作時(shí)遇到的問題并沒有這么簡(jiǎn)單，但這三個(gè)良好習(xí)慣將是正確操作、使用HPLC系統(tǒng)的基礎(chǔ)。
